多种方法检测口咽鳞状细胞癌中HPV感染及基因整合情况的研究

多种方法检测口咽鳞状细胞癌中HPV感染及基因整合情况的研究elisa试剂盒

摘要：目的:本文旨在研究分析HPV感染口咽鳞状细胞癌后DNA整合情况,以及河南地区口咽鳞癌患者人群中HPV的感染情况,总结分析口咽鳞状细胞癌患者的临床病理特征,以期寻求一种准确率高、使用方便、性价比好的口咽鳞癌HPV检测方法,并进一步了解HPV在口咽鳞癌中的致癌机制及基因整合机制。

方法:选择郑州大学附属肿瘤医院病理科存档满足入组条件的口咽鳞癌手术或活检标本89例石蜡包埋蜡块,分别用p16免疫组织化学法(p16 IHC),HPV E6/E7mRNA 3.0 assay法(branched DNA,bDNA),二代测序法(NGS)检测组织中HPV感染情况。其中HPV基因整合情况由二代测序方法检测。并收集89例患者的临床病例资料,分析以上三种方法检测的HPV阳性结果与其临床病理参数的相关性及其临床意义。

实验结果采用SPSS 24.0软件进行统计分析。结果:

1、河南地区口咽部鳞状细胞癌患者中HPV感染率在15%-20%之间。elisa试剂盒p16IHC、bDNA、NGS三种方法HPV阳性检出率分别为:22.5%(20/89),16.9%(15/89),12.4%(11/89)。

2、与患者临床病理资料比较,三种方法与患者的性别、年龄、原发灶部位、肿瘤分化程度、肿瘤T分期等临床参数均无明显相关(P>0.05)。p16 IHC方法检测的HPV结果在N分期淋巴结转移组与非转移组中HPV阳性率分别为40.0%(12/30),11.1%(2/18),差异有统计学意义(P=0.049);在TNM分期Ⅰ-Ⅱ组与Ⅲ-Ⅳ组中分别10.5%(2/19),41.5%(12/29),差异有统计学意义(P=0.026)。而bD与NGS方法检测结果与N分期、TNM分期无明显相关(P>0.05)。

3、以NGS为参照,p16 IHC与bDNA检测方法的敏感性均为63.6%;特异性分别为83.3%、89.7%;阳性预测值分别为35.0%、48.7%;阴性预测值分别为94.2%、94.6%;Kappa值分别为0.348,0.462,p16 IHC和bDNA两方法与NGS方法结果一致性一般。但p16 IHC与bDNA两种方法之间的一致性较好,Kappa值为0.752。

4、NGS检测发现有HPV DNA整合标本11例,其中7例为多条整合,4例为单条整合。共在14条人类染色体上发现整合HPV DNA 33条。elisa试剂盒在这些整合基因组中HPV16型14条、18型19条,其中1号染色体整合数目最多,达39.4%(13/33)。5、对NGS检测单条整合组与多条整合组比较发现,多条整合组标本p16蛋白更易过表达(P=0.044)且bDNA检测拷贝值更高(P=0.043)。

结论:经过三种不同实验对同一批89例口咽鳞癌患者标本进行检测与比较,三种检测方式各有优劣。

1、NGS虽然可在DNA水平准确检测基因序列,但因其检测成本高、技术难度大而不易在临床推广。p16 IHC虽然与bDNA在检测敏感性、特异性、阴/阳性预测值方面结果类似,但在临床实际工作中其操作步骤比bDNA更简便、普及率更高,故推荐p16 IHC作为临床上检测HPV感染的方法。

2、HPV DNA有最高的概率整合到1号染色体上,因此在1号染色体上可能存在与HPV DNA相关的特异性结合位点,但需进一步研究证实。当HPV DNA整合到多条染色体上后其宿主细胞p16蛋白表达及E6/E7 mRNA表达均会增加,这可能会是HPV致癌能力增强的原因之一。

3、NGS作为新一代测序技术,在检测基因组序列、分析不同基因之间关系、基因多态性研究等方面有先天的优势。它将是未来进一步探究HPV致癌机制以及寻找新一代治疗方式的佳选择。