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今日详解:流式样本单细胞悬液的制备方法

发布时间:2020-06-01 10:09 |  点击次数:



想要流式的染色结果好,必须用单细胞悬液,细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。从固态组织样本中制备单细胞悬液需要借助机械分离和(或者)酶消化。操作条件和酶的选择等需要根据经验进行一定的调整。以下是将四种常见的流式样本制备成单细胞悬液的方法
一:组织培养细胞
所需试剂器皿:
1、 Accutase酶 (eBioscience Cat#00-4555)
2、 流式染色缓冲液(eBioscience Cat#00-4222)
3、 15或50ml离心管
实验步骤:
1、 对于悬浮生长的细胞,将细胞转移至离心管中,进行计数和活力分析后进入第3步。
2、 对于贴壁生长的细胞系,我们推荐用Accutase酶将细胞从培养皿中消化下来并分离聚集细胞。将细胞转移至离心管中进行计数和活力分析后进入第3步(注意:Accutase酶会改变某些细胞的表面抗原表位)。
3、 离心后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
二:淋巴组织细胞
一般来说机械分离淋巴组织足够将细胞释放为单细胞悬液。
所需试剂器皿:
1、60mm×15mm的组织培养皿
2、3ml注射器
3、细胞过滤器(尼龙滤网)
4、流式染色缓冲液(eBioscience Cat#00-4222)
5、15或50ml离心管
实验步骤:
1、 将获得的组织(脾脏、淋巴结、胸腺)放入到组织培养皿中,用3ml注射器活塞加压的方法把组织分散为单细胞悬液(或者可以在10ml流式染色缓冲液总用两片载玻片把组织压成糊状);
2、 用10ml流式染色缓冲液收集细胞,并将细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片。将悬液收集到离心管中;
3、 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
4、 重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;
5、 重复步骤3后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
三:非淋巴组织细胞
所需试剂器皿:
1、 剪刀或手术刀片
2、 PBS或其他合适的生理缓冲液
3、 60mm×15mm的组织培养皿
4、 3ml注射器
5、 细胞过滤器(尼龙滤网)
6、 流式染色缓冲液(eBioscience Cat#00-4222)
7、 15或50ml离心管
实验步骤:
1、 将组织用剪刀或手术刀片弄成2-4mm大小的碎块;
2、 加入用PBS稀释的适量的酶,zui合适孵育的时间和温度参考所用酶的操作说明书(注意:酶的种类取决于组织的类型;
3、 用移液枪轻轻吹打分散细胞后,用过滤器过滤除去细胞团和碎片,收集细胞悬液至离心管中;
4、 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
5、 用PBS重悬细胞,去除多余的酶溶液;
6、 按步骤4的方法离心;
7、 重复步骤5和6;
8、 用流式染色缓冲液重悬细胞,并进行计数和活力分析;
9、 按步骤4的方法离心,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。
四:从全血中分离PBMC
所需试剂器皿:
1、 PBS
2、 Ficoll或者其他密度梯度分离液
3、 流式染色缓冲液(eBioscience Cat#00-4222)
4、 15或50ml离心管
实验步骤:
1、 将全血用PBS 1:1在锥形管中稀释;
2、 在稀释的样本上面加入等体积的Ficoll;
3、 1000g离心20min;
4、 将位于PBS和Ficoll层间的PBMC转移到一个新的管中;
5、 加入PBS清洗细胞;
6、 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
7、 用流式染色缓冲液重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;
8、 重复步骤6后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*10^7/ml。