一、匀浆介质
一般选用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定目标的情况自行设定浓度,意图是坚持样本的等渗环境。
二、安排匀浆的制备
1、取安排块(0.2g~0.5g)可到5~10mg在严寒的PBS中漂洗,滤纸拭干,准确称重,放入5ml的匀浆管中。
2、按分量(g):体积(ml)=1:4的份额加入4倍体积的匀浆介质于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪赶快剪碎安排块。
3、匀浆的方法:手艺匀浆,机器匀浆。
① 手艺匀浆:左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下滚动研磨数十次(6~8分钟),充沛研碎,制成20%的匀浆液。
② 机器匀浆:用安排捣碎机10000~15000 转/分 上下研磨制成20%安排匀浆,也可用内切式安排匀浆机制备(匀浆时刻10秒/次,空隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行,可适当延长匀浆时刻),
镜检调查:取少量安排匀浆作涂片(直接涂片、染色均能够),显微镜下调查细胞是否破碎,若没有则可延长匀浆时刻。
4、将制备好的20%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机4000转/分左右,离心10~15分钟,取上清液进行测定.
三、样本保存:
植物安排样本暂时不测定,可当即低温冻存,温度越低越好,中间如不反复冻融,-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。
制备好的匀浆液建议不要冻存,当天进行测定,如放置时刻过长相关酶活会有所下降。